|
|
Tolerance poškození DNA novými, biologicky aktivními komplexy platiny
Vystrčilová, Jana ; Vrána, Oldřich (oponent) ; Nováková,, Olga (vedoucí práce)
Protinádorová aktivita platinových cytostatik je spojována se schopností těchto látek interagovat s DNA. Platinové komplexy mohou změnit strukturu DNA modifikováním bází, zejména quaninů. Biologickým důsledkem takovýchto interakcí jsou změny v replikaci a transkripci. Komplex RNA polymerázy je zastaven v místě poškození DNA a tím označí lézi pro opravné proteiny, které se uplatňují v nukleotidové excizní opravě. Tento mechanismus opravy je spojován s odstraněním objemných DNA poškození z genomu. Hlavním cílem této práce bylo studovat toleranci poškození DNA způsobenými vazbou nových, biologicky aktivních komplexů platiny (II), které obsahují deriváty aromatických cytokininů jako ligandů; cis-[Pt (2-chlor-6-(4-methoxybenzylamino) - 9-isopropylpurin)2Cl2] (PR-001), cis-[Pt (2-chlor-6-(benzylamino)-9-isopropylpurin)2 Cl2 ] (PR-002) a cis-[Pt (2 - (3-hydroxypropylamino) -6 - (benzylamino)-9-isopropylpurin)2 Cl2] (PR-005). Byly připraveny konstrukty DNA, které obsahovaly jednu specifickou DNA lézi a promoterovou sekvenci pro lidskou RNA polymerázu II a bakteriofágovou T7 RNA polymerázu. Metoda přípravy konstruktu využívá polymerázové řetězové reakce (PCR) a biotin-streptavidin interakcí na paramagnetických částicích k purifikaci konečného produktu. Syntetické oligomery (75-mer, 56-mer a 15-mer) jsou ligovány na 5´-biotinovaný pCI-neo-G-less-T7 PCR fragment, kde 15-mer je buď nemodifikován nebo modifikován komlexem PR-005 a cisplatinou. Také byla studována inhibice RNA polymerázové aktivity na globálně modifikovaných plazminech pCI-neo a pUC19 novými platinovými komplexy a cisplatinou. Zjistili jsme, že bifunkční adukty komplexu PR-005 na rozdíl od aduktů PR-001 a PR-002 účinně snižují množství transkriptu plné délky syntetizovaných oběma polymerázami. Tento výsledek lze vysvětlit tím, že vnitrořetězcový můstek a velké aromatické neodstupující ligandy komplexu PR-005 tvoří pro polymerázy výraznou stérickou překážku.
|
|
|
Structural studies of an abasic site DNA damage repair and DNA interstrand cross-link formation
Landová, Barbora ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Poškozením DNA se rozumí jakákoli změna nebo modifikace struktury DNA, která se odchyluje od jejího přirozeného stavu. Abasické místo (Ap místo) je jedním z nejčastějších poškození DNA, které vzniká spontánní depurinací/depyrimidinací nebo enzymatickým odstraněním báze. Pokud se neopraví, může vést ke genetické mutaci a potenciálně způsobit onemocnění, jako je například rakovina. Pochopení mechanismu opravy DNA je zásadní pro lékařský výzkum a aplikaci. Bakteriální MutM je glykosyláza opravující DNA, která odstraňuje poškození DNA vzniklé oxidačním stresem a zabraňuje mutacím a genomové nestabilitě. MutM patří do rodiny prokaryotických enzymů Fpg/Nei a je strukturně i funkčně podobná se svým eukaryotickým protějškům, jako jsou NEIL1-NEIL3. Zde prezentuji dvě krystalové struktury MutM z patogenní Neisseria meningitidis: MutM holoenzym a MutM vázaný na DNA. Volný enzym existuje v otevřené konformaci, zatímco po vazbě na DNA, dochází k podstatným strukturním změnám a přeskupení domén enzymu i ohybu DNA. Jednou z poškození DNA opravovaných MutM je Ap místo, které, pokud není opraveno, může spontánně vést k vytvoření mezivláknového kovanetního prokřízení DNA (Ap-ICL) se sousedním adeninem na opačném vlákně DNA. Je známo, že glykosyláza NEIL3 odstraňuje Ap-ICL. Pomocí série různých oligonukleotidů jsme...
|
|
|
Studium mechanismu opravy mezivláknových křížových vazeb indukovaných alkoholem pomocí nukleasy SLX4-XPF-ERCC1
Havlíková, Jana ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Lux, Vanda (oponent)
Alkohol se řadí mezi nejpoužívanější rekreační drogu na světě, přestože se považuje jako rizikový faktor více než 200 nemocí. Hlavní negativní dopad alkoholu spočívá v jeho metabolitu acetaldehydu, který jakožto vysoce reaktivní sloučenina, může mimo jiné s DNA tvořit mutagenní adukty a mezivláknové křížové vazby, neboli ICL (z angl. Interstrand crosslink). Tvorba ICL, jehož kovalentní charakter blokuje oddělení dvou vláken DNA během replikace, je jedna z důležitých příčin mutageneze a karcinogeneze. Pro udržení genomové stability se vyvinuly opravné mechanismy. Jedním z nich je dráha, která využívá proteiny kódované geny Fanconiho anémie (FA), jejichž defekty vedou ke stejnojmennému onemocnění. Defekty opravných drah mohou být zvláště nebezpečné u osob s nedostatečnou funkčností jiných metabolických drah, jež jsou v případě acetaldehydových ICL alkoholici a osoby s mutacemi v genech, v jejichž důsledku dochází k hromadění toxického acetaldehydu. Teoretická část této práce se zabývá metabolismem alkoholu, in vivo tvorbou acetaldehydu a jeho interakcemi s DNA. Blíže jsou charakterizována ICL a jejich opravné dráhy. Samostatná kapitola je věnovaná FA. Praktická část této práce se zabývá přípravou ICL indukovaného acetaldehydem (zkr. AA-ICL) ve specifické pozici DNA a studiem jeho opravy in vitro. Konkrétně je...
|
|
|
Molecular mechanisms of Wip1 phosphatase function in DNA damage response
Štorchová, Radka ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Fajkus, Jiří (oponent) ; Líčeníková Hořejší, Zuzana (oponent)
Lidské buňky jsou neustále vystaveny různým faktorům, které způsobují poškození DNA a aktivují odpověď na poškození DNA (DDR). V závislosti na závažnosti poškození DNA může DDR napomáhat dočasnému zastavení cyklu buněk (kontrolní bod buněčného cyklu, "checkpoint"), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo programované buněčné smrti (apoptóze). Signál DDR je regulován kaskádou post-translačních modifikací, kde klíčovými mediátory jsou fosfoproteinové kinázy ATM, ATR a DNA-PK. Fosfatáza Wip1 (kódovaná genem PPM1D) hraje důležitou roli v ukončení DDR fosforylací mnoha cílů těchto kináz. V této práci jsme zkoumali funkce PPM1D nezávislé na kontrolních bodech buněčného cyklu v buňkách a popsali jsme několik nových substrátů. Zjistili jsme, že PPM1D interaguje se shelterinovým komplexem a nachází se na telomerách. PPM1D desfosforyluje shelterinový protein TRF2 na S410. Fosforylace TRF2 na S410 zvyšovala jeho interakci s TIN2, což nepřímo zvyšovalo množství TPP1 na telomerách. Buňky s overexpresí PPM1D měly zvýšený počet telomerických fúzí. Tato zjištění mohou být velmi důležitá pro některé typy rakoviny, zvláště ty, které vykazují vysoké hladiny PPM1D nebo obsahují mutace v C-konci PPM1D. Pro ověření publikovaných, a detekci možných nových, substrátů PPM1D jsme vyvinuli novou metodu, využívající...
|
|
|
Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem.
Mašín, Martin ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Martin Mašín Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem. DNA topoizomerasy jsou skupinou enzymů, které jsou schopny měnit topologii DNA pomocí přechodných jednořetězcových nebo dvouřetězcových zlomů (DSB) během fundamentálních procesů jako je replikace a transkripce. Inhibice topoizomerasy II (TOP II) je hlavním mechanismem účinku některých protinádorových léčiv, včetně antracyklinových antibiotik (ANT; např. daunorubicin). Jejich působením dochází k tvorbě DSB a později k apoptóze. Některé další inhibitory TOP II, které působí jiným mechanismem, mohou ovlivňovat vznik DSB nebo jiného poškození DNA, a tak modulovat také účinek ANT. V této diplomové práci jsme studovali poškození DNA v neonatálních potkaních kardiomyocytech vyvolané daunorubicinem (DAU) a jeho hlavním metabolitem daunorubicinolem (DAUnol) a vliv dvou přírodních látek a inhibitorů TOP II, resveratrolu (RES) a kyseliny gambogové (GA), na poškození DNA vyvolané DAU dvěma odlišnými metodami. Stanovovali jsme míru fosforylace histonu H2AX (γ-H2AX) pomocí imunoblotu a porovnali s výsledky získanými pomocí...
|
|
|
Vliv mutovaného huntingtinu na oxidativní stres v primárních fibroblastech izolovaných z knock-in miniprasečího modelu pro Huntingtonovu nemoc
Sekáč, Dávid ; Ellederová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Hanzlíková, Hana (oponent)
Huntingtonova chorea je dominantně dědičné onemocnění způsobené expanzí trinukleotidů (Cytosin-Adenin-Guanin) v genu kódujícím protein huntingtin. Nositelé této mutace vykazují příznaky spojené s motorickým poškozením, kognitivní a psychiatrickou poruchou, která se nazývá Huntingtonova nemoc (HD). Hlavním příznakem HD je striatální atrofie ve středním věku života. Protože je známo, že huntingtinový protein se podílí na mnoha buněčných procesech, jako je transkripční regulace a metabolismus, tyto procesy se mění jeho mutací. Jedním ze znaků pozorovaných v HD patogenezi je přítomnost oxidačního stresu. Cílem práce bylo sledovat molekulární změny, které předchází manifestaci HD v miniprasečím knock-in modelu. Jako materiál pro monitorování molekulárních změn vedoucích k tomuto stavu byly použity primární fibroblasty. Jelikož oxidační stres vzniká z nerovnováhy mezi oxidanty a antioxidanty, byla měřena hladina reaktívnich molekul a peroxidace lipidů spolu s expresí genů spojených s antioxidační odezvou. Současně byla sledována exprese genů souvisejících s metabolismem a opravou DNA. Přestože nebyly zjištěny rozdíly v hladině oxidačního stresu nebo v expresi genů antioxidační odezvy, byly pozorovány změny v expresi genů souvisejících s metabolismem a opravou DNA u fibroblastů z knock-in miniprasat ve...
|
|
|
Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem.
Mašín, Martin ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Martin Mašín Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem. DNA topoizomerasy jsou skupinou enzymů, které jsou schopny měnit topologii DNA pomocí přechodných jednořetězcových nebo dvouřetězcových zlomů (DSB) během fundamentálních procesů jako je replikace a transkripce. Inhibice topoizomerasy II (TOP II) je hlavním mechanismem účinku některých protinádorových léčiv, včetně antracyklinových antibiotik (ANT; např. daunorubicin). Jejich působením dochází k tvorbě DSB a později k apoptóze. Některé další inhibitory TOP II, které působí jiným mechanismem, mohou ovlivňovat vznik DSB nebo jiného poškození DNA, a tak modulovat také účinek ANT. V této diplomové práci jsme studovali poškození DNA v neonatálních potkaních kardiomyocytech vyvolané daunorubicinem (DAU) a jeho hlavním metabolitem daunorubicinolem (DAUnol) a vliv dvou přírodních látek a inhibitorů TOP II, resveratrolu (RES) a kyseliny gambogové (GA), na poškození DNA vyvolané DAU dvěma odlišnými metodami. Stanovovali jsme míru fosforylace histonu H2AX (γ-H2AX) pomocí imunoblotu a porovnali s výsledky získanými pomocí...
|
|
|
Použití spektroskopických technik pro studium interakcí platinových komplexů a nanočástic s nukleovými kyselinami =: Interactions study of nanoparticles and platinum complexes with nucleic acids assessed by spectroscopic techniques /
Nejdl, Lukáš
Schopnost iontů kovů tvořit kovalentní vazbu s nukleovými kyselinami (DNA anebo RNA) je rozhodující pro jejich strukturní vlastnosti a funkce. V 60. letech minulého století byl odhalen potenciál platinových komplexů v protinádorové terapii. Úspěšnost těchto komplexů v protinádorové léčbě je dána jejich schopností vázat se k bázím DNA za tvorby různých typů koordinačních vazeb. Vznik těchto vazeb má za následek ovlivnění sekundární struktury DNA, a tím blokaci důležitých buněčných procesů jako je replikace či transkripce. Předkládaná disertační práce zkoumá schopnost iontů kovů (polokovů) (Zn(II), As(III) a As(V)), nanočástic platiny (PtNPs) a kvantových teček na bázi kadmia (CdS-QDs) ovlivnit sekundární strukturu DNA. V této práci byly nejdříve zkoumány interakce iontů kovů s DNA z důvodu zavedení a ověření instrumentálních metod. Výsledky těchto studií posloužili jako základ pro navazující experimenty zabývající se působením nanočástic na eukaryotickou buňku se zřetelem na poškození DNA. V této práci se podařilo prokázat, že PtNPs mají vyšší afinitu k DNA polymerázám než k samotné DNA. Z tohoto důvodu mohou PtNPs zastavit buněčný cyklus a spustit apoptózu. O míře afinity s jakou se nanočástice váží do struktury DNA, rozhoduje i její velikost, jak bylo prokázáno v experimentech s různě velikými CdS-QDs.
|
|
|
Effect of selected antineoplastic drugs on the gene expression of DNA repair proteins
Klčová, Silvia ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Suchá, Simona (oponent)
Univerzita Karlova v Prahe, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických vied Kandidát: Bc. Silvia Klčová Školiteľ: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Názov práce: Vplyv vybraných protinádorových liečiv na génovú expresiu proteínov účastniacich sa bunkovej odpovede na poškodenie DNA Každá jedna bunka ľudského organizmu je nepretržite vystavovaná širokému spektru stresových faktorov, konzekvenciou ktorých vznikajú poškodenia v molekule DNA. Vzniknuté zmeny predstavujú škálu alterácií - od jednoduchých alkylačných modifikácií báz až po najnepriaznivejšie dvojvláknové zlomy. Vplyv bunkového stresu a následné genotoxické poškodenie DNA je však dvojsečná zbraň. Na jednej strane môžu byť typické alterácie v genóme vyvolané vplyvom mutagénnych agens (ako napríklad zložky tabakového dymu či ionizujúce žiarenie), pričom akumuláciou dôsledkov ich pôsobenia nastane strata kontroly nad jednotlivými krokmi bunkového cyklu, čo vyústi v nádorovú transformáciu bunky. Avšak na strane druhej, navodenie detrimentálneho účinku zasahujúceho do genómu nádorových buniek je jedným zo základných prístupov cytostatickej liečby malignít. V našej práci sme sa preto zamerali na štúdium niekoľkých antineoplastických liečiv široko využívaných v klinickej praxi (etopozid, daunorubicín), či podstupujúcich klinické...
|
|
| |
host ::
RSS.